You are currently viewing تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل

تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل

عزل الدنا الانتقائي

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بعزل الدنا من العوامل الوراثية للدنا من خلال التضخيم الانتقائي لمناطق محددة من الدنا، يمكن تعزيز هذا الاستخدام لتفاعل البوليميراز المتسلسل من خلال عدة طرق، مثل تصنيع مسابر التهجين لتهجين لطخة ساوثرن أو نورثرن وتنسيل الدنا الجزيئي، الذي يتطلب كميات أكبر من الدنا، ويمثّل منطقة محددة من الدنا، يزود تفاعل البوليميراز المتسلسل هذه التقنية بكميات كبيرة من الدنا النقي، ما يسمح بتحليل عينات الدنا حتى من كميات صغيرة من المواد الأولية،

تشمل التطبيقات الأخرى لتفاعل البوليمراز المتسلسل تسلسل الدنا لتحديد تسلسل مُضخم غير معروف من البوليميراز المتسلسل، ويمكن استخدام أحد مشرعات التضخيم في تسلسل سانغر، وعزل تسلسل دنا لتسريع تقنيات الدنا المأشوب التي تنطوي على إدخال تسلسل دنا في البلازميد، أو العاثية، أو الكوزميد (حسب الحجم)، أو المادة الوراثية لكائن آخر، يمكن فحص المستعمرات البكتيرية (مثل الإشريكية القولونية) بسرعة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل لبناء ناقلات دنا بشكل صحيح،

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للبصمات الوراثية، وهي تقنية مستخدمة في الطب الشرعي لتحديد هوية الشخص أو الكائن الحي من خلال مقارنة الدنا التجريبي بناءً على أساليب تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة،

تتمتع بعض طرق «بصمات الأصابع» في تفاعل البوليميراز المتسلسل بقوة تمييزية عالية، ويمكن استخدامها لتحديد العلاقات الجينية بين الأفراد، مثل الوالدين والطفل أو بين الأشقاء، وتُستخدم في اختبار الأبوة، يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد العلاقات التطورية بين الكائنات الحية عند استخدام ساعات جزيئية معينة (على سبيل المثال، S16 rRNA وجينات recA للكائنات الحية الدقيقة)،

رحلانٌ كهربائي لأجزاءٍ من الدنا المُضخم عبر تفاعل البوليمراز المتسلسل (1) الأب، (2) الطفل، (3) الأم،  ورث الطفل بعض بصمات أصابع كل من والديه، وليس كلها، مما منحه بصمة جديدة وفريدة من نوعها،

تضخيم الدنا وقياسه الكمي

نظر إلى أن تفاعل البوليميراز المتسلسل يضخم مناطق الدنا التي يستهدفها، فيمكن استخدامه لتحليل كميات صغيرة للغاية من العينة، هذا أمر بالغ الأهمية في كثير من الأحيان في تحاليل الطب الشرعي، عندما تتوفر فقط كمية ضئيلة من الدنا بصفتها دليل، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في تحليل الدنا اليم الذي يبلغ عمره عشرات الآلاف من السنين ، استُخدمت هذه التقنيات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل بنجاح على الحيوانات، مثل الماموث البالغ من العمر أربعين ألف عام، وعلى الدنا البشري، في تطبيقات تتراوح من تحليل المومياوات المصرية إلى تحديد القيصر الروسي وجسم الملك الإنجليزي ريتشارد الثالث، تسمح طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل بالزمن الحقيقي (qPCR،

يجب عدم الخلط بينه وبين RT-PCR) بتير كمية تسلسل معين موجود في عينة؛ وهي تقنية تُستخدم لتحديد مستويات التعبير الجيني كميًا، يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أداة أساسية في قياس كمية الدنا التي تقيس تراكم نواتج تضخيم الدنا بعد كل دورة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل،

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالتحديد الكمي لكشف تسلسل دنا معين وكشفه في الوقت الحقيقي لأنه يقيس التركيز في أثناء عملية التصنيع، هناك طريقتان للكشف المتزامن والقياس الكمي، تتكون الطريقة الأولى من استخدام الأصباغ الفلورية التي يُحتفظ بها بشكل غير محدد بين الأشرطة المزدوجة، تشتمل الطريقة الثانية على مجسات تُشفر تسلسلات محددة وتَسِمها بالفلور، لا يمكن رؤية الكشف عن الحمض النووي باستخدام هذه الطرق إلا بعد تهجين المسابير باستخدام الدنا المكمل،

التطبيقات الطبية والتشخيصية

يمكن فحص الآباء المحتملين لتحري ما إذا كانوا حاملين لمرض ما أو يمكن فحص أبنائهم لتحديد ما إذا كانوا مصابين بالتليف الكيسي،

يمكن تحصيل عينات من الدنا لفحصها قبل الولادة عن طريق بزل السائل السلوي، وأخذ عينات من الزغابات المشيمية، أو حتى عن طريق تحليل خلايا الجنين النادرة المنتشرة في الجريان الدموي الأموي، تحليل البوليميراز المتسلسل ضروري للتشخيص الوراثي السابق للانغراس، إذ تُفحص خلايا الجنين النامي لتحري وجود طفرات،

  • يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل كجزء من اختبار حساس لتحري التوافق النسيجي، وهو أمر ضروري في عملية زراعة الأعضاء، اعتبارًا من عام 2008، هناك اقتراح للاستعاضة عن الاختبارات القائمة على الأجسام المضادة التقليدية لفصيلة الدم باختبارات قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل،

تتضمن العديد من أشكال السرطان تعديلات على الجينات السرطانية، باستخدام الاختبارات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل لدراسة هذه الطفرات، يمكن في بعض الأحيان تخصيص خطط علاجية فردية للمرضى، يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتشخيص المبكر للأمراض الخبيثة مثل ابيضاض الدم والأورام اللمفاوية، التي تعد حالي الأكثر تطور في أبحاث السرطان وتُستخدم روتينيًا بالفعل،

يمكن إجراء فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرةً على عينات من العوامل الوراثية للدنا للكشف عن الخلايا الخبيثة الخاصة بالإزفاء بحساسية تصل إلى عشرة آلاف ضعف حساسية الطرق الأخرى، تفاعل البوليميراز المتسلسل مفيد للغاية في المجال الطبي لأنه يسمح بعزل كابحات الورم وتضخيمها، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مثلًا في تحديد كمية الخلايا المفردة وتحليلها، بالإضافة إلى التعرف على تركيبات الدنا والرنا والبروتين وتأكيداتها،

التطبيقات في مجال الأمراض المعدية

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتشخيص السريع والدقيق للأمراض المعدية، بما في ذلك الأمراض التي تسببها البكتيريا أو الفيروسات، يسمح بتحديد الكائنات الحية الدقيقة غير القابلة للزراعة أو بطيئة النمو مثل المتفطرات أو البكتيريا اللاهوائية أو الفيروسات من فحوصات زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية، أساس تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصي في علم الأحياء الدقيقة هو الكشف عن العوامل المعدية وتمييز السلالات غير الممرضة عن السلالات الممرضة من خلال جينات محددة،

أحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل ثورة في عملية كشف الكائنات الحية المعدية وتمييزها بالطرق الآتية:

  • يُعد فيروس نقص المناعة البشرية هدف يصعب إيجاده والقضاء عليه، اعتمدت الاختبارات المبكرة للعدوى على وجود أجسام مضادة للفيروس المنتشر في الجريان الدموي، ومع ذلك، لا تظهر الأجسام المضادة حتى أسابيع عديدة بعد الإصابة، والأجسام المضادة للأمهات تُقنّع إصابة الوليد، ولا تؤثر العوامل العلاجية لمحاربة العدوى على الأجسام المضادة، طُورت فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي يمكنها اكتشاف ما لا يقل عن جينوم فيروسي واحد بين الحمض النووي لأكثر من 50,000 خلية مضيفة،
  • يمكن الكشف عن العدوى باكرًا، ويمكن فحص وجود الفيروس في الدم المتبرع به، ويمكن فحص المولودين حديثًا مباشرةً، ويمكن قياس الآثار للعلاجية للأدوية المضادة لفيروسات،
  • يصعب أخذ عينات من بعض العضويات الممرضة، مثل المتفطرة السلية، وتكون بطيئة النمو على أوساط الزرع، أتاحت الاختبارات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل المجال للكشف عن أعداد صغيرة من الكائنات الممرضة (سواء الحية أو الميتة)، في عينات مناسبة، يمكن استخدام التحليل الجيني المفصل للكشف عن مقاومة المضادات الحيوية، ما يسمح بالعلاج الفوري والفعال، يمكن تقييم آثار العلاج فوريًا،
  • يمكن مراقبة انتشار كائنات حية ممرضة بين جمهرة من الحيوانات المنزلية أو البرية من خلال الاختبارات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل، في كثير من الحالات، يمكن الكشف عن ظهور أنواع فرعية جديدة خبيثة ومراقبتها، يمكن تحديد الأنواع الفرعية للكائن المسؤول عن الأوبئة السابقة من خلال تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل،
  • يمكن تحري الدنا الفيروسي من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل، يجب أن تكون المشرعات المستخدمة خاصة بتسلسل الدنا الفيروسي المستهدف ويمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في التحليل التشخيصي أو تسلسل الدنا للجينوم الفيروسي، تسمح الحساسية العالية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالكشف عن الفيروس بعد فترة وجيزة من الإصابة وحتى قبل ظهور المرض، يمنح هذا الكشف المبكر الأطباء مهلة زمنية كبيرة في العلاج،
  • يمكن قياس كمية الفيروس (الحمل الفيروسي) لدى المريض من خلال تقنيات قياس كمية الدنا القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل،
  • هناك أمراض مثل الشاهوق (السعال الديكي) تسببها بكتيريا البورتيديلا الشاهوقية، تتميز هذه البكتيريا بإحداثها خمجًا تنفسيًا حادًا خطيرًا يصيب العديد من الحيوانات والبشر ويؤدي إلى وفاة العديد من الأطفال الصغار، ذيفان الشاهوق هو ذيفان خارجي بروتيني يربط مستقبلات الخلايا بعاملين ويتفاعل مع أنواع مختلفة من الخلايا مثل الخلايا اللمفاوية التائية التي تلعب دورًا في المناعة الخلوية،

تفاعل البوليميراز المتسلسل هو وسيلة تشخيصية هامة يمكنها كشف التسلسلات ضمن جين ذيفان الشاهوق، لأن حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل للذيفانات عالية، ولأنه يظهر النتائج في وقت سريع، لذلك فهو فعال في تشخيص السعال الديكي مقارنةً بالزرع،

تطبيقات الطب الشرعي

شهد تطوير بروتوكولات بصمات الأصابع الجينية (أو الدنا) المعتمدة على تفاعل البوليميراز المتسلسل تطبيقًا واسعًا في علم الأدلة الجنائية:

  • يمكن أن تميز البصمة الوراثية بشكل فريد أي شخص في العالم، وذلك في أكثر أشكالها تميزًا، يمكن عزل عينات دقيقة من الدنا من مسرح الجريمة، ومقارنتها مع دنا المشتبه بهم، أو مع قاعدة بيانات الدنا للأدلة السابقة أو المدانين، تُستخدم النسخ الأبسط من هذه الاختبارات لاستبعاد المشتبه بهم بسرعة في أثناء التحقيق الجنائي، يمكن فحص الأدلة المستمدة من الجرائم التي استمرت لعقود، وتأكيد الأشخاص المدانين أصلًا أو تبرئتهم،
  • كانت مطابقة الدنا في الطب الشرعي وسيلة فعالة في تحديد المشتبه بهم الجنائيين أو تبرئتهم بسبب تحليل الأدلة المكتشفة في مسرح الجريمة، يحتوي الجينوم البشري على العديد من المناطق المتكررة التي يمكن العثور عليها في تسلسل الجينات أو في المناطق غير المشفرة من الجينوم، على وجه التحديد، إن ما يصل إلى 40% من الحمض النووي البشري متكرر،

هناك فئتان مميزتان لهذه المناطق المتكررة غير المشفرة في الجينوم، تُسمى الفئة الأولى التكرارات المترادفة ذات الرقم المتغير (VNTR)، التي يبلغ طولها من 10 إلى 100 زوج قاعدي، وتُسمى الفئة الثانية التكرارات المترادفة القصيرة (STR) وتتكون من 2-10 أزواج قاعدية مكررة، يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم العديد من VNTRs وSTRs المعروفة باستخدام المشرعات التي تحيط بكل منطقة من المناطق المتكررة،

تشير أحجام الشظايا التي استخلصت من أي فرد إلى كل من التكرارات المترادفة القصيرة إلى الألائل الموجودة، من خلال تحليل العديد من التكرارات المترادفة القصيرة، سيتم العثور على مجموعة من الأليلات لكل شخص والتي من المحتمل أن تكون فريدة إحصائيًا، حدد الباحثون التسلسل الكامل للجينوم البشري،

يمكن الوصول إلى هذا التسلسل بسهولة من خلال موقع NCBI، وهو يُستخدم في العديد من التطبيقات على أرض الواقع، على سبيل المثال، جمّع مكتب التحقيقات الفدرالي مجموعة من مواقع الدنا الواسم المستخدمة في تحديد الهوية، وتُسمى هذه قاعدة بيانات الدنا لنظام فهرسة الدنا المجموعي، يمكّن استخدام التحليل الإحصائي لقاعدة البيانات هذه من تحديد احتمال تطابق عينة من الدنا، يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل أداة تحليلية قوية ومهمة لاستخدامها في توافق الدنا في الطب الشرعي لأن الباحثين يحتاجون في هذه الحالة إلى عينة صغيرة من الدنا لاستخدامها في التحليل،

على سبيل المثال، تحتوي شعرة بشرية واحدة مع البصلة المرتبطة بها على دنا كافٍ لإجراء التحليل، وبالمثل، فإن القليل من الحيوانات المنوية وعينات الجلد من تحت الأظافر أو كمية صغيرة من الدم توفر ما يكفي من الدنا للتحليل القاطع، تساعد الأشكال الأقل تميزًا من بصمة الدنا في تحليل الأبوة المعتمد على الدنا، إذ يُطابَق الفرد مع أقربائه من الدرجات الأولى والثانية، يمكن تحليل الدنا من بقايا بشرية مجهولة الهوية ومقارنتها بالآباء أو الأشقاء أو الأطفال المحتملين،

يمكن استخدام اختبار مماثل لتأكيد الوالدين البيولوجيين لطفل متبنى (أو مختطف)، يمكن تأكيد الأب البيولوجي الفعلي لحديثي الولادة (أو استبعاده)،ثبت أن تصميم AMGX/AMGY لتفاعل البوليميراز المتسلسل لا يُسهل تضخيم تسلسلات الدنا من كمية ضئيلة من الجينوم وحسب، بل يمكن استخدامه لتحديد الجنس في الوقت الفعلي من عينات العظام في الطب الشرعي، وهذا لا يوفر لنا طريقة قوية وفعالة لتحديد جنس العينات اليمة فحسب، بل لتحديد المشتبه بهم الحاليين في الجرائم،

التطبيقات في الأبحاث

طُبّق تفاعل البوليمراز المتسلسل على العديد من المجالات البحثية في علم الوراثة الجزيئية:

  • يسمح تفاعل البوليمراز المتسلسل بالإنتاج السريع لقطع صغيرة من الدنا، حتى عندما لا يُعرف أكثر من تسلسل بادئتين، تعزز مرة هذا التفاعل العديد من الطرق، مثل توليد مسبارات تهجين للطختي نورثرن وساوثرن، يزوّد تفاعل البوليمراز المتسلسل هذه التقنيات بكميات كبيرة من الدنا النقي، والتي تكون أحيانًا شريطًا مفردًا، ما يتيح التحليل حتى لكميات صغيرة من مادة البدء،
  • يساعد تفاعل البوليمراز التسلسلي وظيفة تسلسل الدنا، يمكن أن ينتِج بسهولة الأجزاء المعروفة من دنا مريض يعاني من طفرة مرضية وراثية، يمكن للتعديلات على تقنية التضخيم أن تستخرج قطعًا من جينوم غير معروف بالكامل، أو يمكنها إنتاج شريط واحد فقط من المنطقة المرغوب نسخها،
  • يحتوي تفاعل البوليمراز المتسلسل على العديد من التطبيقات مقارنة بعملية تنسيل الدنا التقليدية، يمكنه استخراج قطعًا لإدخالها في ناقل من جينوم أكبر، التي يمكن أن تكون متاحة فقط بكميات صغيرة، باستخدام مجموعة واحدة من «بادئات الناقل»، يمكنه تحليل أو استخراج أجزاء مُدخَلة بالفعل في نواقل، يمكن أن تؤدي بعض التعديلات على بروتوكول تفاعل البوليمراز المتسلسل إلى توليد طفرات (عامّة أو موجّهة نحو الموقع) للجزء المُدَرج،
  • مواقع واصمات التسلسل عمليةٌ يُستخدَم فيها تفاعل البوليمراز المتسلسل بمثابة مؤشر لوجود قطعة محددة من الجينوم في نسيلة معينة، وجد مشروع الجينوم البشري هذا التطبيق شديد الأهمية لرسم خرائط النسائل الكونية للسلاسل، ولتنسيق النتائج من المختبرات المختلفة،
  • أحد تطبيقات تفاعل البوليمراز المتسلسل المثيرة للاهتمام هو التحليل التطوري للسلالات باستخدام دنا المصادر اليمة، مثل الدنا الموجود في عظام النياندرتال المُستخرجة أو في أنسجة الماموث المجمدة أو في أدمغة المومياوات المصرية، إذ ضُخّم وسُلسِل، في بعض الحالات، يمكن أن يُعاد تجميع الدنا المتحلل بشدة من هذه المصادر خلال المراحل الأولى من التضخيم،
  • أحد التطبيقات الشائعة لتفاعل البوليمراز المتسلسل دراسة أنماط التعبير الجيني، يمكن تحليل الأنسجة (أو حتى الخلايا الفردية) في مراحل مختلفة لمعرفة الجينات التي أصبحت نشطة، أو التي أُوقِف عملها، يُمكن لهذا التطبيق استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالزمن الحقيقي لقياس المستويات الفعلية للتعبير الجيني،
  • عزّزت رة تفاعل البوليمراز المتسلسل في تضخيمه عدة مواقع جينية في وقت واحد للحيوانات المنوية لأشخاص
  • بشكل كبير المهمة التقليدية لرسم الخرائط الجينية من خلال دراسة التعابر الكروموسومي بعد الانقسام المنصف، لُوحظت بشكل مباشر أحداث تعابر كروموسومي نادرة بين مواقع جينية قريبة خلال تحليل آلاف الحيوانات المنوية للأفراد، وبشكل مشابه، يمكن تحليل عمليات الحذف أو الإدراج أو الانتقالات أو الانقلابات غير المألوفة، كل ذلك دون الحاجة إلى الانتظار (أو الدفع) لعمليات الإخصاب الطويلة والمرهقة والتخلّق المضغي، وغيرها،
  • التطفّر نوعيّ الموقع: يمكن استخدام تفاعل البوليمراز المتسلسل لإنشاء جينات طافرة مع وجود لطفرات يختارها العلماء حسب رغبتهم، يمكن اختيار هذه الطفرات من أجل فهم كيفية قيام البروتينات بوظائفها وتغيير وظيفة بروتين أو تحسينها،

المزايا

لتفاعل البوليميراز المتسلسل العديد من المزايا، من السهل فهم النتائج واستخدامها وتحقيقها بسرعة، هذه التقنية حساسة للغاية مع إمكانية إنتاج ملايين إلى مليارات النسخ من منتج معين للتسلسل والاستنساخ والتحليل، يشترك qRT-PCR مع تفاعل البوليميراز المتسلسل بنفس المزايا، مع ميزة إضافية هي إمكانية تحديد كمية المنتج المركب، ولذلك، فإن لها استخداماتها في تحليل التغيرات في مستويات التعبير الجيني في الأورام، أو الأحياء الدقيقة، أو الحالات المرضية الأخرى،

تفاعل البوليميراز المتسلسل هو أداة بحثية قوية وعملية للغاية، يمكن التعرف على تسلسل مسببات غير معروفة للعديد من الأمراض من خلاله، تساعد التقنية في تحديد تسلسل الفيروسات غير المعروفة سابقًا والمتصلة بالفيروسات المعروفة مسبقًا ما يحقق فهمًا أفضل للمرض بحد ذاته، في حال وجود إمكانية لتبسيط الإجراء أكثر أو تطوير أنظمة تقصٍّ حساسة غير إشعاعية، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل سيحتل مكانة بارزة في المختبرات السريرية في السنوات القادمة،

 

اترك رد